Klinická farmakologie a farmacie – 1/2021

KLINICKÁ FARMAKOLOGIE A FARMACIE / Klin Farmakol Farm 2021; 35(1): 24–28 / www.klinickafarmakologie.cz 26 HLAVNÍ TÉMA Analytické metody pro stanovení cefazolinu deuterované sloučeniny, například cefazo- lin-D3 (17, 18). Deuterované sloučeniny jsou analyzované látce nejvíce podobné, a proto jsou nejvhodnějšími standardy. Nejsou však vhodné pro UV detekci, jelikož absorbují při stejné vlnové délce a nelze je na analytické koloně separovat vzhledem ke stejnému re- tenčnímu času. Množství biologického vzorku použitého pro stanovení se pohybuje nejčastěji mezi 50–200µl a závisí na použité metodě zpraco- vání vzorku i na způsobu detekce (16, 18–24). Metody stanovení Existuje celá řada metod, kterými lze koncentraci cefazolinu v biologickém vzor- ku stanovit. Ačkoliv mnoho publikací uvádí, že je daná metoda funkční, nemusí být pro rutinní použití vhodná. Analytická metoda by měla být přesná, správná, reprodukova- telná, musí splňovat validační parametry pro laboratorní analytické metody ve zdravotnic- tví a v ideálním případě také rychlá a levná. Nejvýznamnější zastoupení zde mají chro- matografické metody. V současnosti je nejrozšířenější metodou stanovení koncentrací léčiv v biologickém materiálu vysokoúčinná kapalinová chroma- tografie (HPLC) s různými typy detekce. Tato separační technika využívá rozdílné distribuce látek mezi stacionární a mobilní fází. Analyt v eluátu je poté detekován pomocí různých detektorů. Nejčastěji se používají spektrofo- tometrické UV-Vis detektory, jejichž podsta- tou je snímání transmitance při definované vlnové délce. Méně často se pak setkáme se spojením HPLC s fluorescenčním či elektro- chemickým detektorem (ECD), které však mohou být citlivější oproti UV-Vis detektoru (14). Stanovení koncentrace cefazolinu po- mocí fluorescenčního detektoru je založeno na degradaci cefazolinu za alkalických pod- mínek a současné detekce fluorescenčního záření vzniklého produktu. Množství světla emitovaného produktem degradace kore- luje s počáteční koncentrací cefazolinu (25). Nevýhodou metody je složitá preanalytická úprava vzorku a důsledná kontrola pH, proto není pro rutinní TDM vhodná (15). Metoda HPLC-ECD taktéž není pro rutinní stanovení cefazolinu příliš vhodná, a to především kvůli nutnosti použití vhodné elektrody, často i spe- ciálně modifikované. Princip detekce spočívá v měření proudu vyvolaného při průchodu cefazolinuměrnou celou obsahující elektrody, na něž je vloženo pracovní napětí. Proudová odpověď poté přímo odpovídá koncentraci elektroaktivní látky (14). Ovšem nejvýznamnější metodou pro stanovení cefazolinu i dalších léčivých látek je HPLC‑MS, již zmíněna výše, případně ultra- účinná kapalinová chromatografie s hmot- nostní detekcí (UHPLC‑MS). Tyto metody lze zkráceně označit LC-MS. Metody LC-MS jsou založeny na separaci látek a jejich následné detekci na základě poměru jejich hmotnos- ti a náboje (m/z). V případě využití trojitého kvadrupólu je každá látka charakterizována prekurzorovým iontem a produktovými ion- ty, díky kterým může být přesně a specificky identifikována i kvantifikována. Pro využití této metody tak nemusí být jednotlivé látky ve vzorku zcela separovány, což zjednodušuje preanalytické úpravy a urychluje samotnou analýzu (14, 26). Na konkrétní příklady stanovení cefa- zolinu pomocí kapalinové chromatografie s UV‑Vis nebo MS detekcí odkazuje Tab. 2, která charakterizuje vybrané metody vhodné pro rutinní stanovení koncentrace cefazolinu v biologickém vzorku. Imunoanalytické metody jsou založené na měření koncentrace analytu v roztoku pomocí protilátky. Základem metody je tedy reakce antigenu s protilátkou, kde je jedna složka (častěji antigen‑léčivo) značena a identifiko- vána. Ačkoliv jsou tyto metody komerčně dostupné pro glykopeptidy a aminoglyko- sidy, pro měření cefazolinu z krevní plazmy dostupné nejsou. Avšak existuje několik pu- blikací popisujících analýzu cefalosporinů v potravinářství, zejména stanovení reziduí v mléce (15, 26). Analytický rozsah zvolené metody by měl být stanoven pro každý konkrétní analyt (sta- novené léčivo) při zohlednění MIC infekčního agens. Dolní mez stanovitelnosti (LLOQ) by v ideálním případě měla být nižší než MIC patogenu, a naopak horní mez stanovitel- nosti (ULOQ) by měla být dostatečně vyso- ká, aby obsáhla vysoké koncentrace léčiva, a současně rozsah kalibrační křivky zůstal lineární (13, 15). Nesprávně nastavený analy- tický rozsah metody může vést k nepřesným výsledkům, což může vést k nesprávné nebo zbytečné úpravě dávky léčiva. Stanovení volné a vázané frakce Měření volné frakce léčiva má význam ze- jména u antibiotik s vysokou vazebností na plazmatické proteiny. V poslední době však roste zájem o měření volných frakcí i u anti- biotik s nízkou vazebností. Zejména u kriticky nemocných pacientů se setkáváme s vysokou variabilitou a nepředvídatelností koncentrace volné frakce léčiva. Vysoká variabilita ve vaz- bě na plazmatické bílkoviny je zapříčiněna Tab. 2. Charakteristika vybraných chromatografických metod pro rutinní stanovení cefazolinu Detektor Typ kolony Typ matrice Příprava vzorku IS Počet stanovovaných ATB v metodě Volná frakce RT Celkový čas analýzy Citace UV, 272nm C18 (100×3mm; 2,7µm) PL, IST precipitace metronidazol 2  3,6 5 (16) MS/MS C18 (50×2,1 mm; 2,6µm) PL, CSF precipitace D3-cefazolin 8 x 2,1 8 (18) MS/MS C18 (50×2mm; 3µm) PL SPE ethylparaben 8 x 6 13 (19) MS/MS C18 (50×2,1mm; 2,6µm) PL precipitace fukunazol 7 x 3,8 7 (20) UV, 260nm C18 (30×4,6mm; 2,5µm) PL precipitace cefotaxim 12 x 3,7 25 (21) MS/MS C18 (50×2,1mm; 1,7µm) PL SPE D4-cefadroxil 13 x 1,9 4 (22) UV, 260nm C18 (30×4,6mm; 2,5µm) PL ultrafiltrace x 10  4,4 7 (23) MS/MS C18 (100×2,1mm; 1,7µm) PL precipitace D5-ampicilin 2 x 2,7 5,5 (24) MS/MS C12 (75×2mm; 4µm) PL precipitace D9-trimethoprim 9  1,4 9 (30) IS – interní standard; RT – retenční čas;  – byla měřena volná frakce; PL – plazma; CSF – mozkomíšní mok; IST – intersticiální tekutina; MS/MS – tandemová hmotnostní spek- trometrie; x – není specifikováno (18, 20, 22–28)